Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak od tri slajda odjednom.Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće da se krećete kroz tri slajda odjednom ili koristite dugmad klizača na kraju da se krećete kroz tri slajda odjednom.
Razvijen je ultra-kompaktan (54 × 58 × 8,5 mm) i široki otvor blende (1 × 7 mm) devetobojni spektrometar, “podjeljen na dva” nizom od deset dikroičnih ogledala, koji je korišten za trenutno spektralno snimanje.Upadni svjetlosni tok s poprečnim presjekom manjim od veličine otvora podijeljen je na kontinuiranu traku širine 20 nm i devet tokova boja sa centralnim valnim dužinama od 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 i 690 nm.Senzor slike istovremeno efikasno meri slike od devet tokova boja.Za razliku od konvencionalnih nizova dihroičnih ogledala, razvijeni dikroični niz ogledala ima jedinstvenu dvodelnu konfiguraciju, koja ne samo da povećava broj boja koje se mogu meriti istovremeno, već i poboljšava rezoluciju slike za svaki tok boja.Razvijeni spektrometar u devet boja koristi se za četverokapilarnu elektroforezu.Simultana kvantitativna analiza osam boja koje istovremeno migriraju u svakoj kapilari korištenjem fluorescencije izazvane laserom u devet boja.Budući da spektrometar s devet boja nije samo ultra-mali i jeftin, već ima i visok svjetlosni tok i dovoljnu spektralnu rezoluciju za većinu primjena spektralnog snimanja, može se široko koristiti u različitim poljima.
Hiperspektralno i multispektralno snimanje postalo je važan dio astronomije2, daljinskog istraživanja za posmatranje Zemlje3,4, kontrole kvaliteta hrane i vode5,6, konzervacije umjetnosti i arheologije7, forenzike8, hirurgije9, biomedicinske analize i dijagnostike10,11 itd. Polje 1 Neophodna tehnologija ,12,13.Metode za mjerenje spektra svjetlosti koje emituje svaka tačka emisije u vidnom polju dijele se na (1) skeniranje tačke („metla”)14,15, (2) linearno skeniranje („metlica”)16,17,18 , (3) dužina skenira talase19,20,21 i (4) slike22,23,24,25.U slučaju svih ovih metoda, prostorna rezolucija, spektralna rezolucija i vremenska rezolucija imaju odnos kompromisa9,10,12,26.Osim toga, izlaz svjetlosti ima značajan utjecaj na osjetljivost, odnosno na omjer signala i šuma u spektralnom snimanju26.Svjetlosni tok, odnosno efikasnost korištenja svjetlosti, direktno je proporcionalan omjeru stvarne izmjerene količine svjetlosti svake svjetlosne tačke u jedinici vremena i ukupne količine svjetlosti izmjerenog opsega talasnih dužina.Kategorija (4) je prikladna metoda kada se intenzitet ili spektar svjetlosti koju emituje svaka emitivna tačka mijenja s vremenom ili kada se pozicija svake emitivne tačke mijenja s vremenom jer se spektar svjetlosti koju emituju sve emitivne tačke mjeri istovremeno.24.
Većina gore navedenih metoda se kombinuje sa velikim, složenim i/ili skupim spektrometrima koji koriste 18 rešetki ili 14, 16, 22, 23 prizme za klase (1), (2) i (4) ili 20, 21 filter diskove, filtere za tečnost .Kristalni podesivi filteri (LCTF)25 ili akusto-optički podesivi filteri (AOTF)19 kategorije (3).Nasuprot tome, spektrometri sa više ogledala kategorije (4) su mali i jeftini zbog svoje jednostavne konfiguracije27,28,29,30.Osim toga, imaju visok svjetlosni tok jer se svjetlost koju dijeli svako dihroično ogledalo (to jest, propuštena i reflektovana svjetlost upadne svjetlosti na svakom dikroičkom ogledalu) u potpunosti i kontinuirano koristi.Međutim, broj opsega talasnih dužina (tj. boja) koji se moraju meriti istovremeno je ograničen na oko četiri.
Spektralno snimanje zasnovano na detekciji fluorescencije se obično koristi za multipleksnu analizu u biomedicinskoj detekciji i dijagnostici 10, 13 .U multipleksiranju, budući da su višestruki analiti (npr. specifična DNK ili proteini) označeni različitim fluorescentnim bojama, svaki analit prisutan na svakoj emisionoj tački u vidnom polju se kvantificira korištenjem višekomponentne analize.32 razbija detektovani spektar fluorescencije koji emituje svaka tačka emisije.Tokom ovog procesa, različite boje, od kojih svaka emituje različitu fluorescenciju, mogu se kolokalizirati, odnosno koegzistirati u prostoru i vremenu.Trenutno, maksimalni broj boja koje se mogu pobuditi jednim laserskim snopom je osam33.Ova gornja granica nije određena spektralnom rezolucijom (tj. brojem boja), već širinom spektra fluorescencije (≥50 nm) i količinom Stokesovog pomaka boje (≤200 nm) na FRET (koristeći FRET)10 .Međutim, broj boja mora biti veći ili jednak broju boja kako bi se eliminiralo spektralno preklapanje miješanih boja31,32.Stoga je potrebno povećati broj istovremeno mjerenih boja na osam ili više.
Nedavno je razvijen ultra-kompaktni heptahroični spektrometar (koji koristi niz heptihroičnih ogledala i senzor slike za mjerenje četiri fluorescentna fluksa).Spektrometar je dva do tri reda veličine manji od konvencionalnih spektrometara koji koriste rešetke ili przme34,35.Međutim, teško je postaviti više od sedam dikroičnih ogledala u spektrometar i istovremeno izmjeriti više od sedam boja36,37.Sa povećanjem broja dihroičnih ogledala povećava se maksimalna razlika u dužinama optičkih putanja dikroičnih svetlosnih tokova i postaje teško prikazati sve svetlosne tokove na jednoj senzornoj ravni.Povećava se i najduža optička putanja svjetlosnog toka, pa se širina otvora spektrometra (tj. maksimalna širina svjetlosti koju analizira spektrometar) smanjuje.
Kao odgovor na gore navedene probleme, razvijen je ultrakompaktni spektrometar u devet boja sa dvoslojnim „dihroičnim“ dekakromatskim nizom ogledala i senzorom slike za trenutno spektralno snimanje [kategorija (4)].U poređenju sa prethodnim spektrometrima, razvijeni spektrometar ima manju razliku u maksimalnoj dužini optičkog puta i manjoj maksimalnoj dužini optičkog puta.Primijenjen je na četverokapilarnu elektroforezu za detekciju laserski inducirane fluorescencije u devet boja i za kvantifikaciju istovremene migracije osam boja u svakoj kapilari.Budući da razvijeni spektrometar nije samo ultra-mali i jeftin, već ima i visok svjetlosni tok i dovoljnu spektralnu rezoluciju za većinu primjena spektralnog snimanja, može se široko koristiti u različitim poljima.
Tradicionalni spektrometar sa devet boja prikazan je na sl.1a.Njegov dizajn prati prethodni ultra-mali spektrometar sa sedam boja 31. Sastoji se od devet dihroičnih ogledala raspoređenih horizontalno pod uglom od 45° udesno, a senzor slike (S) nalazi se iznad devet dihroičnih ogledala.Svjetlost koja ulazi odozdo (C0) podijeljena je nizom od devet dihroičnih ogledala u devet svjetlosnih tokova koji idu prema gore (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 i C9).Svih devet tokova boja se direktno dovode do senzora slike i detektuju se istovremeno.U ovoj studiji, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 i C9 su poređani po talasnoj dužini i predstavljeni su magenta, ljubičasta, plava, cijan, zelena, žuta, narandžasta, crveno-narandžasta i crvena, respektivno.Iako se ove oznake boja koriste u ovom dokumentu, kao što je prikazano na slici 3, jer se razlikuju od stvarnih boja koje vidi ljudsko oko.
Šematski dijagrami konvencionalnih i novih spektrometara sa devet boja.(a) Konvencionalni spektrometar sa devet boja sa nizom od devet dihroičnih ogledala.(b) Novi spektrometar u devet boja sa dvoslojnim dihroičnim nizom ogledala.Upadni svjetlosni tok C0 podijeljen je na devet obojenih svjetlosnih tokova C1-C9 i detektuje ih senzor slike S.
Razvijeni novi spektrometar u devet boja ima dvoslojnu dikroičnu zrcalnu rešetku i senzor slike, kao što je prikazano na slici 1b.U donjem sloju pet dihroičnih ogledala nagnuto je za 45° udesno, poravnato udesno od središta niza dekamera.Na gornjem nivou, pet dodatnih dihroičnih ogledala nagnuto je 45° ulevo i locirano od centra ulevo.Krajnje lijevo dihroično ogledalo donjeg sloja i krajnje desno dikroično ogledalo gornjeg sloja se preklapaju.Upadni svjetlosni tok (C0) podijeljen je odozdo na četiri izlazna hromatska toka (C1-C4) sa pet dikroičnih ogledala na desnoj strani i pet izlaznih hromatskih tokova (C5-C4) sa pet dihroičnih ogledala na lijevoj strani C9).Kao i konvencionalni spektrometri sa devet boja, svih devet tokova boja se direktno ubrizgavaju u senzor slike (S) i detektuju istovremeno.Upoređujući slike 1a i 1b, može se vidjeti da su u slučaju novog spektrometra sa devet boja i maksimalna razlika i najduža optička putanja od devet tokova boja prepolovljene.
Detaljna konstrukcija ultra malog dvoslojnog dikroičnog niza ogledala 29 mm (širina) × 31 mm (dubina) × 6 mm (visina) prikazana je na slici 2. Decimalni niz dihroičnih ogledala sastoji se od pet dihroičnih ogledala na desnoj strani. (M1-M5) i pet dihroičnih ogledala na lijevoj strani (M6-M9 i još jedno M5), svako dihroično ogledalo je fiksirano u gornjem aluminijskom nosaču.Sva dihroična ogledala su raspoređena kako bi se kompenzirao paralelni pomak zbog prelamanja toka kroz ogledala.Ispod M1 je fiksiran band-pass filter (BP).Dimenzije M1 i BP su 10 mm (duža strana) x 1,9 mm (kratka strana) x 0,5 mm (debljina).Dimenzije preostalih dihroičnih ogledala su 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.Korak matrice između M1 i M2 je 1,7 mm, dok je korak matrice ostalih dihroičnih ogledala 1,6 mm.Na sl.2c kombinuje upadni svjetlosni tok C0 i devet obojenih svjetlosnih tokova C1-C9, razdvojenih matricom ogledala za de-komoru.
Konstrukcija dvoslojne dihroične matrice ogledala.(a) Pogled u perspektivi i (b) pogled poprečnog presjeka dvoslojnog dikroičnog niza ogledala (dimenzije 29 mm x 31 mm x 6 mm).Sastoji se od pet dihroičnih zrcala (M1-M5) smještenih u donjem sloju, pet dihroičnih ogledala (M6-M9 i još jedno M5) smještenih u gornjem sloju i propusnog filtera (BP) koji se nalazi ispod M1.(c) Prikaz poprečnog presjeka u vertikalnom smjeru, sa C0 i C1-C9 preklapanjem.
Širina otvora u horizontalnom smjeru, naznačena širinom C0 na slici 2, c, je 1 mm, au smjeru okomitom na ravninu slike 2, c, dato dizajnom aluminijumskog nosača, – 7 mm.Odnosno, novi spektrometar sa devet boja ima veliku veličinu otvora od 1 mm × 7 mm.Optička putanja C4 je najduža među C1-C9, a optička putanja C4 unutar niza dihroičnih ogledala, zbog gornje ultra male veličine (29 mm × 31 mm × 6 mm), iznosi 12 mm.Istovremeno, dužina optičkog puta C5 je najkraća među C1-C9, a dužina optičkog puta C5 je 5,7 mm.Dakle, maksimalna razlika u dužini optičkog puta je 6,3 mm.Gore navedene dužine optičkih putanja su korigirane za optičku dužinu putanje za optički prijenos M1-M9 i BP (od kvarca).
Spektralna svojstva M1−M9 i VR su izračunata tako da su fluksovi S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 i S9 u opsegu talasnih dužina 520–540, 540–560, 560–580, 580 –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 i 680–700 nm, respektivno.
Fotografija proizvedene matrice dekahromatskih ogledala prikazana je na slici 3a.M1-M9 i BP su zalijepljeni na nagib od 45 stepeni i horizontalnu ravan aluminijumskog nosača, respektivno, dok su M1 i BP skriveni na poleđini slike.
Izrada niza dekanskih ogledala i njihova demonstracija.(a) Niz fabrikovanih dekahromatskih ogledala.(b) 1 mm × 7 mm podijeljena slika u devet boja projektovana na list papira postavljena ispred niza dekakromatskih ogledala i osvijetljena bijelim svjetlom.(c) Niz dekohromatskih ogledala osvijetljenih bijelom svjetlošću s leđa.(d) Devetobojni mlaz cijepanja koji izlazi iz niza ogledala od dekana, posmatrano postavljanjem dimom ispunjenog akrilnog kanistera ispred niza ogledala od dekana na c i zamračenjem prostorije.
Izmjereni spektri transmisije M1-M9 C0 pod upadnim uglom od 45° i izmjereni spektar transmisije BP C0 pod upadnim uglom od 0° prikazani su na sl.4a.Spektri transmisije C1-C9 u odnosu na C0 prikazani su na Sl.4b.Ovi spektri su izračunati iz spektra na Sl.4a u skladu sa optičkom putanjom C1-C9 na slici 4a.1b i 2c.Na primjer, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], gdje je TS(X) i [ 1 − TS(X)] su spektri transmisije i refleksije X, respektivno.Kao što je prikazano na slici 4b, propusni opseg (propusnost ≥50%) za C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 i C9 su 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 i 682-699 nm.Ovi rezultati su u skladu sa razvijenim rasponima.Osim toga, efikasnost korištenja C0 svjetlosti je visoka, odnosno prosječna maksimalna propusnost C1-C9 svjetlosti je 92%.
Spektri prijenosa dikroičnog zrcala i podijeljenog fluksa devet boja.(a) Izmjereni spektri transmisije M1-M9 pri incidenciji od 45° i BP pri incidenciji od 0°.(b) Spektri transmisije C1–C9 u odnosu na C0 izračunati iz (a).
Na sl.3c, niz dihroičnih ogledala postavljen je vertikalno, tako da je njegova desna strana na slici 3a gornja strana, a bijeli snop kolimirane LED diode (C0) je pozadinsko osvijetljen.Niz dekakromatskih ogledala prikazan na slici 3a montiran je u adapter 54 mm (visina) × 58 mm (dubina) × 8,5 mm (debljina).Na sl.3d, pored stanja prikazanog na sl.3c, akrilni rezervoar ispunjen dimom postavljen je ispred niza dekohromatskih ogledala, sa ugašenim svetlima u prostoriji.Kao rezultat, devet dihroičnih strujanja je vidljivo u rezervoaru, koji izviru iz niza dekatroičkih ogledala.Svaki podijeljeni tok ima pravokutni poprečni presjek dimenzija 1 × 7 mm, što odgovara veličini otvora novog spektrometra s devet boja.Na slici 3b, list papira je postavljen ispred niza dihroičnih ogledala na slici 3c, a iz smjera kretanja papira promatra se slika 1 x 7 mm devet dihroičnih struja projektovanih na papir.potoci.Devet tokova razdvajanja boja na sl.3b i d su C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 i C9 od vrha do dna, što se može vidjeti i na slikama 1 i 2. 1b i 2c.Oni se posmatraju u bojama koje odgovaraju njihovim talasnim dužinama.Zbog niskog intenziteta bijelog svjetla LED-a (pogledajte dodatnu sliku S3) i osjetljivosti kamere u boji koja se koristi za snimanje C9 (682–699 nm) na slici. Ostali tokovi cijepanja su slabi.Slično, C9 je bio slabo vidljiv golim okom.U međuvremenu, C2 (drugi tok odozgo) izgleda zeleno na slici 3, ali izgleda više žuto golim okom.
Prijelaz sa slike 3c na d prikazan je u dodatnom videu 1. Odmah nakon što bijela svjetlost iz LED diode prođe kroz dekakromatski niz ogledala, dijeli se istovremeno na devet tokova boja.Na kraju se dim u bačvi postepeno razilazio odozgo prema dolje, tako da je i devet obojenih prahova nestalo odozgo prema dolje.Nasuprot tome, u Dodatnom videu 2, kada je talasna dužina svetlosnog toka koji pada na niz dekahromatskih ogledala promenjena iz dugačkih u kratka u redosledu od 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 i 532 nm ., Prikazuju se samo odgovarajući podeljeni tokovi od devet podeljenih tokova redosleda C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 i C1.Akrilni rezervoar je zamenjen kvarcnim bazenom, a ljuspice svakog šantovanog toka mogu se jasno posmatrati iz nagnutog pravca naviše.Pored toga, pod-video 3 se edituje tako da se ponovo reprodukuje deo promene talasne dužine pod-videa 2.Ovo je najelokventniji izraz karakteristika dekohromatskog niza ogledala.
Gore navedeni rezultati pokazuju da proizvedeni dekakromatski niz ogledala ili novi spektrometar sa devet boja radi kako je predviđeno.Novi spektrometar sa devet boja formiran je postavljanjem niza dekahromatskih ogledala sa adapterima direktno na ploču senzora slike.
Svjetlosni tok s rasponom valnih dužina od 400 do 750 nm, emitovan od strane četiri tačke zračenja φ50 μm, smještene u intervalima od 1 mm u smjeru okomitom na ravninu slike 2c, odnosno Istraživanja 31, 34. Niz sa četiri sočiva se sastoji od četiri sočiva φ1 mm sa žižnom daljinom od 1,4 mm i nagibom od 1 mm.Četiri kolimirana toka (četiri C0) upadaju na DP novog spektrometra od devet boja, raspoređenih u intervalima od 1 mm.Niz dikroičnih ogledala dijeli svaki tok (C0) na devet tokova boja (C1-C9).Rezultirajućih 36 tokova (četiri seta C1-C9) se zatim ubrizgavaju direktno u CMOS (S) senzor slike direktno povezan sa nizom dihroičnih ogledala.Kao rezultat, kao što je prikazano na slici 5a, zbog male maksimalne razlike optičke putanje i kratke maksimalne optičke putanje, slike svih 36 tokova su detektovane istovremeno i jasno sa istom veličinom.Prema nizvodnim spektrima (vidi dodatnu sliku S4), intenzitet slike četiri grupe C1, C2 i C3 je relativno nizak.Trideset šest slika bilo je veličine 0,57 ± 0,05 mm (srednja vrijednost ± SD).Tako je uvećanje slike u prosjeku iznosilo 11,4.Vertikalni razmak između slika je u prosjeku 1 mm (isti razmak kao niz sočiva), a horizontalni razmak je u prosjeku 1,6 mm (isti razmak kao kod dikroičnog niza ogledala).Pošto je veličina slike mnogo manja od udaljenosti između slika, svaka slika se može meriti nezavisno (sa malim preslušavanjem).U međuvremenu, slike dvadeset osam tokova snimljenih konvencionalnim spektrometrom od sedam boja korišćenim u našoj prethodnoj studiji prikazane su na slici 5 B. Niz od sedam dikroičnih ogledala je kreiran uklanjanjem dva krajnja desna dikroična ogledala iz niza od devet dikroičnih ogledala. ogledala na slici 1a.Nisu sve slike oštre, veličina slike se povećava sa C1 na C7.Dvadeset osam slika su veličine 0,70 ± 0,19 mm.Stoga je teško održati visoku rezoluciju slike na svim slikama.Koeficijent varijacije (CV) za veličinu slike 28 na slici 5b bio je 28%, dok je CV za veličinu slike 36 na slici 5a smanjen na 9%.Gore navedeni rezultati pokazuju da novi spektrometar sa devet boja ne samo da povećava broj istovremeno mjerenih boja sa sedam na devet, već ima i visoku rezoluciju slike za svaku boju.
Usporedba kvaliteta podijeljene slike koju formiraju konvencionalni i novi spektrometri.(a) Četiri grupe slika razdvojenih u devet boja (C1-C9) koje generiše novi spektrometar sa devet boja.(b) Četiri seta slika razdvojenih u sedam boja (C1-C7) formiranih konvencionalnim spektrometrom od sedam boja.Tokovi (C0) sa talasnim dužinama od 400 do 750 nm iz četiri tačke emisije se kolimiraju i upadaju na svaki spektrometar, respektivno.
Spektralne karakteristike spektrometra sa devet boja su eksperimentalno procijenjene, a rezultati evaluacije prikazani su na slici 6. Imajte na umu da slika 6a pokazuje iste rezultate kao i slika 5a, tj. na talasnim dužinama od 4 C0 400–750 nm, detektuje se svih 36 slika (4 grupe C1–C9).Naprotiv, kao što je prikazano na slici 6b–j, kada svaki C0 ima specifičnu talasnu dužinu od 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 ili 690 nm, postoje skoro samo četiri odgovarajuće slike (četiri grupe otkrivene C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 ili C9).Međutim, neke od slika uz četiri odgovarajuće slike su vrlo slabo detektirane jer se spektri transmisije C1–C9 prikazani na slici 4b blago preklapaju i svaki C0 ima pojas od 10 nm na određenoj talasnoj dužini kako je opisano u metodi.Ovi rezultati su u skladu sa spektrima transmisije C1-C9 prikazanim na Sl.4b i dodatni video snimci 2 i 3. Drugim riječima, spektrometar sa devet boja radi kako se očekuje na osnovu rezultata prikazanih na sl.4b.Stoga se zaključuje da je raspodjela intenziteta slike C1-C9 spektar svakog C0.
Spektralne karakteristike spektrometra sa devet boja.Novi spektrometar sa devet boja generiše četiri seta slika razdvojenih u devet boja (C1-C9) kada upadna svetlost (četiri C0) ima talasnu dužinu (a) 400-750 nm (kao što je prikazano na slici 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, respektivno.
Razvijeni spektrometar u devet boja korišten je za četverokapilarnu elektroforezu (za detalje pogledajte Dodatni materijali)31,34,35.Četvorokapilarni matriks se sastoji od četiri kapilare (spoljni prečnik 360 μm i unutrašnji prečnik 50 μm) smeštene u intervalima od 1 mm na mestu laserskog zračenja.Uzorci koji sadrže fragmente DNK označene sa 8 boja, odnosno FL-6C (boja 1), JOE-6C (boja 2), dR6G (boja 3), TMR-6C (boja 4), CXR-6C (boja 5), TOM- 6C (boja 6), LIZ (boja 7) i WEN (boja 8) u rastućem redosledu fluorescentne talasne dužine, razdvojeni u svakoj od četiri kapilare (u daljem tekstu Cap1, Cap2, Cap3 i Cap4).Laserski indukovana fluorescencija iz Cap1-Cap4 kolimirana je nizom od četiri sočiva i istovremeno snimljena spektrometrom od devet boja.Dinamika intenziteta devetobojne (C1-C9) fluorescencije tokom elektroforeze, odnosno elektroforegrama u devet boja svake kapilare, prikazana je na slici 7a.Ekvivalentni elektroforegram u devet boja dobija se u Cap1-Cap4.Kao što je prikazano strelicama Cap1 na slici 7a, osam vrhova na svakom elektroforegramu u devet boja pokazuje jednu emisiju fluorescencije iz Dye1-Dye8, respektivno.
Simultana kvantifikacija osam boja pomoću spektrometra za elektroforezu sa četiri kapilare u devet boja.(a) Elektroforegram u devet boja (C1-C9) svake kapilare.Osam vrhova označenih strelicama Cap1 pokazuju pojedinačne emisije fluorescencije osam boja (Dye1-Dye8).Boje strelica odgovaraju bojama (b) i (c).(b) Spektri fluorescencije osam boja (Dye1-Dye8) po kapilari.c Elektroferogrami od osam boja (Dye1-Dye8) po kapilari.Vrhovi fragmenata DNK označenih Dye7 označeni su strelicama, a njihove dužine Cap4 baza su naznačene.
Raspodjela intenziteta C1–C9 na osam vrhova prikazana je na Sl.7b, respektivno.Pošto su i C1-C9 i Dye1-Dye8 u redu talasnih dužina, osam distribucija na slici 7b prikazuje spektre fluorescencije Dye1-Dye8 uzastopno s leva na desno.U ovoj studiji, Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 i Dye8 se pojavljuju u magenta, ljubičasta, plava, cijan, zelena, žuta, narandžasta i crvena, redom.Imajte na umu da boje strelica na slici 7a odgovaraju bojama boje na slici 7b.Intenzitet fluorescencije C1-C9 za svaki spektar na slici 7b je normalizovan tako da je njihov zbir jednak jedan.Osam ekvivalentnih spektra fluorescencije dobijeno je iz Cap1-Cap4.Može se jasno uočiti spektralno preklapanje fluorescencije između boje 1-boje 8.
Kao što je prikazano na slici 7c, za svaku kapilaru, elektroforegram u devet boja na slici 7a pretvoren je u elektroferogram sa osam boja multikomponentnom analizom zasnovanom na osam spektra fluorescencije na slici 7b (pogledajte dodatne materijale za detalje).Pošto spektralno preklapanje fluorescencije na slici 7a nije prikazano na slici 7c, Dye1-Dye8 se može identifikovati i kvantificirati pojedinačno u svakoj vremenskoj tački, čak i ako različite količine Dye1-Dye8 fluoresciraju u isto vrijeme.Ovo se ne može učiniti tradicionalnom detekcijom u sedam boja31, ali se može postići razvijenom detekcijom u devet boja.Kao što je prikazano strelicama Cap1 na slici 7c, samo singleti fluorescentne emisije Dye3 (plava), Dye8 (crvena), Dye5 (zelena), Dye4 (cijan), Dye2 (ljubičasta), Dye1 (magenta) i Dye6 (žuta ) se posmatraju očekivanim hronološkim redom.Za fluorescentnu emisiju boje 7 (narandžasta), pored jednog pika označenog narandžastom strelicom, uočeno je još nekoliko pojedinačnih pikova.Ovaj rezultat je zbog činjenice da su uzorci sadržavali standarde veličine, Dye7 označene DNK fragmente različite dužine baza.Kao što je prikazano na slici 7c, za Cap4 ove osnovne dužine su 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 i 220 osnovnih dužina.
Glavne karakteristike spektrometra sa devet boja, razvijenog pomoću matrice dvoslojnih dihroičnih ogledala, su mala veličina i jednostavan dizajn.Budući da je niz dekahromatskih ogledala unutar adaptera prikazan na sl.3c montiran direktno na ploču senzora slike (vidi slike S1 i S2), spektrometar sa devet boja ima iste dimenzije kao i adapter, tj. 54 × 58 × 8,5 mm.(debljina) .Ova ultra-mala veličina je dva do tri reda veličine manja od konvencionalnih spektrometara koji koriste rešetke ili prizme.Pored toga, pošto je spektrometar sa devet boja konfigurisan tako da svetlost pada na površinu senzora slike okomito, prostor se može lako dodeliti spektrometaru sa devet boja u sistemima kao što su mikroskopi, protočni citometri ili analizatori.Analizator elektroforeze kapilarne rešetke za još veću minijaturizaciju sistema.Istovremeno, veličina deset dihroičnih ogledala i propusnih filtera koji se koriste u spektrometru sa devet boja je samo 10×1,9×0,5 mm ili 15×1,9×0,5 mm.Dakle, više od 100 takvih malih dihroičnih zrcala i propusnih filtara, respektivno, može se izrezati iz dihroičnog zrcala i 60 mm2 propusnog filtera, respektivno.Stoga se niz dekakromatskih ogledala može proizvesti po niskoj cijeni.
Još jedna karakteristika spektrometra sa devet boja su njegove odlične spektralne karakteristike.Konkretno, omogućava akviziciju spektralnih slika snimaka, odnosno istovremenu akviziciju slika sa spektralnim informacijama.Za svaku sliku dobijen je kontinuirani spektar sa opsegom talasnih dužina od 520 do 700 nm i rezolucijom od 20 nm.Drugim riječima, za svaku sliku detektuje se devet intenziteta boje svjetlosti, odnosno devet traka od 20 nm koje podjednako dijele raspon talasnih dužina od 520 do 700 nm.Promjenom spektralnih karakteristika dikroičnog zrcala i filtera pojasnog propuštanja, raspon talasnih dužina devet opsega i širina svake trake mogu se podesiti.Detekcija devet boja može se koristiti ne samo za mjerenja fluorescencije sa spektralnim slikama (kao što je opisano u ovom izvještaju), već i za mnoge druge uobičajene aplikacije koje koriste spektralno snimanje.Iako hiperspektralna slika može otkriti stotine boja, otkriveno je da čak i uz značajno smanjenje broja boja koje se mogu detektirati, višestruki objekti u vidnom polju mogu se identificirati s dovoljnom preciznošću za mnoge primjene38,39,40.Budući da prostorna rezolucija, spektralna rezolucija i vremenska rezolucija imaju kompromis u spektralnom prikazu, smanjenje broja boja može poboljšati prostornu rezoluciju i vremensku rezoluciju.Također može koristiti jednostavne spektrometre poput onog razvijenog u ovoj studiji i dodatno smanjiti količinu izračunavanja.
U ovoj studiji, osam boja je kvantifikovano istovremeno spektralnim razdvajanjem njihovih preklapajućih fluorescentnih spektra na osnovu detekcije devet boja.Do devet boja se može kvantifikovati istovremeno, koegzistirajući u vremenu i prostoru.Posebna prednost spektrometra sa devet boja je njegov veliki svjetlosni tok i veliki otvor blende (1 × 7 mm).Dekanski niz ogledala ima maksimalan prenos od 92% svetlosti iz otvora u svakom od devet opsega talasnih dužina.Efikasnost korišćenja upadne svetlosti u opsegu talasnih dužina od 520 do 700 nm je skoro 100%.U tako širokom rasponu talasnih dužina, nijedna difrakciona rešetka ne može pružiti tako visoku efikasnost upotrebe.Čak i ako efikasnost difrakcije difrakcione rešetke prelazi 90% na određenoj talasnoj dužini, kako se povećava razlika između te talasne dužine i određene talasne dužine, efikasnost difrakcije na drugoj talasnoj dužini se smanjuje41.Širina otvora okomita na smjer ravnine na slici 2c može se proširiti od 7 mm do širine senzora slike, kao što je slučaj sa senzorom slike koji se koristi u ovoj studiji, blagim modifikacijom dekamernog niza.
Spektrometar sa devet boja može se koristiti ne samo za kapilarnu elektroforezu, kao što je prikazano u ovoj studiji, već i za razne druge svrhe.Na primjer, kao što je prikazano na donjoj slici, spektrometar sa devet boja može se primijeniti na fluorescentni mikroskop.Ravan uzorka se prikazuje na senzoru slike spektrometra sa devet boja kroz 10x objektiv.Optička udaljenost između sočiva objektiva i senzora slike je 200 mm, dok je optička udaljenost između upadne površine spektrometra od devet boja i senzora slike samo 12 mm.Stoga je slika izrezana na približno veličinu otvora (1 × 7 mm) u ravni upada i podijeljena na devet slika u boji.To jest, spektralna slika snimka u devet boja može se napraviti na površini od 0,1×0,7 mm u ravni uzorka.Osim toga, moguće je dobiti spektralnu sliku u devet boja veće površine na ravni uzorka skeniranjem uzorka u odnosu na objektiv u horizontalnom smjeru na slici 2c.
Komponente dekakromatskog niza ogledala, odnosno M1-M9 i BP, izradila je Asahi Spectra Co., Ltd. po narudžbi koristeći standardne metode precipitacije.Višeslojni dielektrični materijali naneseni su pojedinačno na deset kvarcnih ploča veličine 60 × 60 mm i debljine 0,5 mm, ispunjavajući sljedeće zahtjeve: M1: IA = 45°, R ≥ 90% na 520–590 nm, Tave ≥ 90% na 610– 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90% na 520–530 nm, Tave ≥ 90% na 550–600 nm, M3: IA = 45°, R ≥ 90% na 540–550 nm, Tave ≥ % na 570–600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90% na 560–570 nm, Tave ≥ 90% na 590–600 nm, M5: IA = 45°, R ≥ 98% na 580–60 nm , R ≥ 98% na 680–700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90% na 600–610 nm, R ≥ 90% na 630–700 nm, M7: IA = 45°, R ≥ ≥ 90 nm 620–630 nm, Taw ≥ 90% na 650–700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90% na 640–650 nm, Taw ≥ 90% na 670–700 nm, M9: R IA = ≥ 90% na 650-670 nm, Tave ≥ 90% na 690-700 nm, BP: IA = 0°, T ≤ 0,01% na 505 nm, Tave ≥ 95% na 530-690 nm na 9% T ≥ na -690 nm i T ≤ 1% na 725-750 nm, gdje su IA, T, Tave i R ugao upada, propusnost, prosječna propusnost i nepolarizirana refleksija svjetlosti.
Bijela svjetlost (C0) s opsegom talasnih dužina od 400–750 nm koju emituje LED izvor svjetlosti (AS 3000, AS ONE CORPORATION) je kolimirana i padala je vertikalno na DP niza dikroičnih ogledala.Bijeli svjetlosni spektar LED dioda prikazan je na dodatnoj slici S3.Postavite akrilni rezervoar (dimenzija 150 × 150 × 30 mm) direktno ispred niza ogledala dekamera, nasuprot PSU.Dim koji je nastao kada je suvi led uronjen u vodu potom je sipan u akrilni rezervoar da bi se posmatrali podeljeni mlazovi C1-C9 u devet boja koji izviru iz niza dekahromatskih ogledala.
Alternativno, kolimirano bijelo svjetlo (C0) prolazi kroz filter prije ulaska u DP.Filteri su prvobitno bili filteri neutralne gustine sa optičkom gustinom od 0,6.Zatim koristite motorizirani filter (FW212C, FW212C, Thorlabs).Na kraju, ponovo uključite ND filter.Širina pojasa devet propusnih filtera odgovara C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 i C1, respektivno.Kvarcna ćelija unutrašnjih dimenzija 40 (optička dužina) x 42,5 (visina) x 10 mm (širina) postavljena je ispred niza dekohromatskih ogledala, nasuprot BP.Dim se zatim dovodi kroz cijev u kvarcnu ćeliju kako bi se održala koncentracija dima u kvarcnoj ćeliji kako bi se vizualizirali podijeljeni tokovi C1-C9 u devet boja koji izviru iz dekakromatskog niza ogledala.
Video snimak podeljenog svetlosnog toka u devet boja koji izvire iz niza dekanskih ogledala snimljen je u time-lapse modu na iPhone XS.Snimite slike scene pri 1 fps i kompajlirajte slike da biste kreirali video pri 30 fps (za opcionalni video 1) ili 24 fps (za opcionalne video zapise 2 i 3).
Postavite ploču od nerđajućeg čelika debljine 50 µm (sa četiri rupe prečnika 50 µm u intervalima od 1 mm) na difuzionu ploču.Svjetlost talasne dužine od 400-750 nm zrači se na ploču difuzora, koja se dobija prolaskom svetlosti iz halogene lampe kroz kratki transmisioni filter sa graničnom talasnom dužinom od 700 nm.Svjetlosni spektar prikazan je na dodatnoj slici S4.Alternativno, svjetlost također prolazi kroz jedan od 10 nm propusnih filtera sa centrima na 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 i 690 nm i udara u ploču difuzora.Kao rezultat toga, na ploči od nehrđajućeg čelika nasuprot ploče difuzora formirane su četiri točke zračenja promjera φ50 μm i različitih valnih dužina.
Četvorokapilarni niz sa četiri sočiva postavljen je na spektrometar od devet boja kao što je prikazano na slikama 1 i 2. C1 i C2.Četiri kapilare i četiri sočiva su bila ista kao u prethodnim studijama31,34.Laserski snop talasne dužine 505 nm i snage 15 mW se istovremeno i ravnomerno zrači sa strane na emisione tačke četiri kapilare.Fluorescencija koju emituje svaka tačka emisije je kolimirana odgovarajućim sočivom i razdvojena u devet tokova boja nizom dekahromatskih ogledala.Rezultirajućih 36 tokova je zatim direktno ubrizgano u CMOS senzor slike (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.), a njihove slike su istovremeno snimljene.
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), 4 µl GeneScan™ 600 LIZ™ boje pomiješano je za svaku kapilaru miješanjem 1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 µl standard veličine mješavine.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) i 14 µl vode.PowerPlex® 6C Matrix Standard se sastoji od šest fragmenata DNK označenih sa šest boja: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C i WEN, prema maksimalnoj talasnoj dužini.Bazne dužine ovih DNK fragmenata nisu otkrivene, ali je poznata sekvenca dužine baze fragmenata DNK označenih sa WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C i TOM-6C.Smjesa u ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction kompletu sadrži fragment DNK označen bojom dR6G.Dužine baza fragmenata DNK također nisu otkrivene.GeneScan™ 600 LIZ™ Standard veličine boje v2.0 uključuje 36 LIZ-obilježenih DNK fragmenata.Osnovne dužine ovih DNK fragmenata su 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 300, 280, 300, 300 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 i 600 baza.Uzorci su denaturirani na 94°C 3 minute, a zatim hlađeni na ledu 5 minuta.Uzorci su ubrizgani u svaku kapilaru pri 26 V/cm u trajanju od 9 s i odvojeni u svakoj kapilari ispunjenoj otopinom polimera POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) efektivne dužine od 36 cm i napona od 181 V/cm i ugao od 60°.OD.
Svi podaci dobijeni ili analizirani tokom ovog istraživanja uključeni su u ovaj objavljeni članak i njegove dodatne informacije.Ostali podaci relevantni za ovu studiju dostupni su od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Khan, MJ, Khan, HS, Yousaf, A., Khurshid, K., i Abbas, A. Trenutni trendovi u analizi hiperspektralne slike: pregled.Pristupite IEEE 6, 14118–14129.https://doi.org/10.1109/ACCESS.2018.2812999 (2018).
Vaughan, AH Astronomska interferometrijska Fabry-Perotova spektroskopija.instalirati.Velečasni Astron.astrofizika.5, 139-167.https://doi.org/10.1146/annurev.aa.05.090167.001035 (1967).
Goetz, AFH, Wein, G., Solomon, JE i Rock, BN Spektroskopija slika Zemlje daljinskim ispitivanjem.Science 228, 1147–1153.https://doi.org/10.1126/science.228.4704.1147 (1985).
Yokoya, N., Grohnfeldt, C. i Chanussot, J. Fuzija hiperspektralnih i multispektralnih podataka: uporedni pregled nedavnih publikacija.IEEE Earth Sciences.Časopis daljinske detekcije.5:29–56.https://doi.org/10.1109/MGRS.2016.2637824 (2017).
Gowen, AA, O'Donnell, SP, Cullen, PJ, Downey, G. i Frias, JM Hyperspectral imaging je novi analitički alat za kontrolu kvaliteta i sigurnost hrane.Trendovi u nauci o hrani.tehnologije.18, 590-598.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2007.06.001 (2007).
ElMasri, G., Mandour, N., Al-Rejaye, S., Belin, E. i Rousseau, D. Nedavne primjene multispektralnog imidžinga za praćenje fenotipa i kvaliteta sjemena – pregled.Senzori 19, 1090 (2019).
Liang, H. Napredak u multispektralnoj i hiperspektralnoj slici za arheologiju i očuvanje umjetnosti.Prijavite se za fizičku 106, 309–323.https://doi.org/10.1007/s00339-011-6689-1 (2012).
Edelman GJ, Gaston E., van Leeuwen TG, Cullen PJ i Alders MKG Hiperspektralna slika za beskontaktnu analizu forenzičkih tragova.Kriminalistika.interni 223, 28-39.https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.09.012 (2012).
Vrijeme objave: Jan-10-2023